qPCR做完以后，大家免不了要对生成的数据进行分析处理，除了要对Ct值进行整理分析以外，同样要对实验过程中产生的扩增曲线和熔解曲线进行比较分析。接下来就给大家介绍一下这两种曲线的定义和实操中遇到的各种问题和解决方法。
对于荧光定量 PCR 结果好坏的判断，最直观就是查看扩增曲线是否符合正常标准。如果是做染料法 qPCR，还需要检查熔解曲线是否符合标准。想要对实验结果进行分析，那么我们就首先需要弄清楚 扩增曲线和 熔解曲线。
扩增曲线的定义:
扩增曲线是指PCR过程中，以循环数为横坐标，以反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线。
基线是早期循环的噪点水平，通常在第3~15循环之间测量，这是因为在此期间还检测不到扩增产物，引起的荧光值增加。用于计算基线的循环数量是可以改变的，如果使用高模板量或者靶标基因的表达水平高则循环数量需要减少。
优秀的扩增曲线应有以下特点：基线平直或略微下降，无明显的上扬趋势；曲线拐点清楚，指数期斜率与扩增效率成正比，斜率越大扩增效率越高；扩增曲线整体平行性好，表明各管的扩增效率相近；低浓度样本扩增曲线指数期明显。
熔解曲线（求导曲线）的定义：
随着PCR的进行，双链产物的不断增加，嵌入到双链中的荧光分子也不断增多，荧光信号逐渐增强。在扩增结束后，体系内的双链产物最多，荧光信号强度达到一个最高值。之后我们设置一段由65℃逐渐升温到95℃的程序，随着温度逐渐升高，DNA双链逐渐解链为单链，嵌入到双链中的荧光染料分子也会逐渐脱落下来，荧光信号强度逐渐下降。在某段温度时，双链迅速而大量地解链，荧光信号强度骤然下降，在这段温度中，一半的双链解链的温度我们称为熔解温度（即Tm值）。最终，DNA双链完全解链为单链，荧光值下降为一个本底水平。这一整体过程中的荧光信号随温度变化的曲线就是熔解曲线，称为原始图谱。该图谱做负导数换算后得到熔解曲线的导数图谱，导数图谱会出现熔解峰，熔解峰对应的温度就是Tm值。
由于熔解温度即是该DNA片段的Tm值，以此可以判断影响DNA片段Tm值的一些参数，比如片段大小、GC含量等等。一般来说，根据我们的引物设计原则，扩增产物长度在80-300bp范围，那么熔解温度应该是在80℃-90℃之间。
熔解曲线的解读：如果在80℃-90℃之间出现唯一主峰，说明荧光定量PCR完美；如果在80℃-90℃之间出现主峰，80℃以下出现杂峰，基本考虑引物二聚体，可尝试提高退火温度解决；如果在80℃-90℃之间出现主峰，温度上升又出现杂峰，基本上考虑有DNA污染，需要在实验初始阶段去除DNA。
曲线分析之扩增曲线：
1、荧光定量PCR实验结果中无Ct值出现
原因分析及解决方案：
（1）PCR参数设置错误：在设计循环参数时没有设置荧光信号采集；
（2）模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况；
（3）引物或者探针降解：可通过PAGE电泳检测其完整性；
（4）电脑设置了自动休眠。
建议按照原因分析进行一一核查
2、扩增曲线不光滑
原因分析及解决方案：
（1）仪器长时间未校准，在检测中出现了波动；
（2）RNA 模板不纯。
建议定期校准仪器，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 RNA 模板。
3、 扩增曲线平台期抖动
原因分析及解决方案：
仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。建议尝试更换仪器重新实验。
4、扩增曲线右下方下落呈倒扣状
原因分析及解决方案：
模板浓度过高，基线终点值大于 CT 值，仪器默认起峰位置仍为基线期，将起峰位置往基线下拉，所以扩增曲线变成了倒扣的 S 形。建议可适当减小基线范围，手动调整基线终点值至 CT 值 -4，调整基线范围后，扩增曲线即恢复正常。
5、Ct值偏大（如Ct值＞30）
原因分析及解决方案：
(1) 模板量低或基因表达丰度低，建议增加模板量观察Ct值能否成相应倍数减少。
(2) qPCR整个反应条件不适宜或引物设计不当导致扩增效率低，建议通过标准曲线确认扩增效率。
(3) 扩增产物过长，建议用三步法程序扩增或通过优化引物，扩增产物长度最好不超过300bp。
(4) 体系中可能存在抑制剂影响酶的活性，建议梯度稀释模板或重新制备纯度更高的模板。
6、扩增曲线无法达到平台期
原因分析及解决方案：
基因丰度低、循环数较少，建议增加循环数或选择适合低丰度基因定量的产品。
7、扩增曲线平台期锯齿状
原因分析及解决方案：
(1) RNA纯度低，建议梯度加大模板稀释倍数看优化效果或重新制备高纯度RNA重新实验。
(2) 仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。
8、复孔重复性差
原因分析及解决方案：
(1) 加样误差导致，建议移液器定期校准，另外可通过扩大反应体系或提前配制好预混液优化。
(2) 模板量低，建议提高模板量，使Ct值落在15-30之间。
(3) 仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养
9、扩增曲线基线期上飘
原因分析及解决方案：
可能的原因：仪器默认基线期范围较小，可手动将基线范围调大，扩增曲线即恢复正常。
曲线分析之扩增曲线：
1、有扩增曲线，无熔解曲线
原因分析及解决方案：
可能是熔解程序设置错误，未搜集荧光信号，建议重新实验，增加熔解曲线阶段的信号搜集。
2、 双峰，杂峰Tm在80℃之前
原因分析及解决方案：
(1) 可能存在引物二聚体，建议降低引物浓度或重新设计引物等方式优化。
(2) 可能是模板量过低，促使了引物二聚体的形成，建议提高模板量。
3、双峰，杂峰Tm在80℃之后
原因分析及解决方案：
(1) 引物特异性过差导致非特异性产物扩增，建议Blast检查引物特异性或重新设计引物。
(2) gDNA污染，可通过NRC进行确认。若NRC有Ct值，可重新制备模板。
4、熔解曲线单峰但不尖锐
原因分析及解决方案：
可能存在大小相近的非特异性产物，建议进行高分辨率琼脂糖电泳确认。
5、熔解曲线单峰但Tm值在80℃以前
原因分析及解决方案：
推测未加模板，仅有引物二聚体的扩增。进行高分辨率琼脂糖电泳确认产物或重复实验。
6、熔解曲线峰型杂乱
原因分析及解决方案：
(1) 反应体系污染，结合NTC和NRC结果确认污染情况，建议从水，引物，酶和环境等逐一排除污染。
(2) 试剂暴露在强光或高温下导致试剂失效，建议用新的试剂做对比实验。
(3) 仪器长时间未校准，建议定期进行仪器校准保养。
(4) 耗材与仪器不匹配，需确认对应仪器对耗材的要求。
7、两种试剂平行对比，同一产物Tm值不同
原因分析及解决方案：
可能是不同试剂的促解链成分或含量不一样，导致同一产物解链温度Tm值不一样。
8、熔解曲线前端起杂峰
原因分析及解决方案：
可能是ROX浓度与机型不匹配，建议取消ROX校正查看熔解曲线是否正常。
【注】可以在仪器上将参比染料设置由ROX更改为NONE，取消ROX的校正功能，查看熔解曲线是否恢复正常，即可判定是否是ROX导致的。
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NovoStart®SYBR qPCR SuperMix plus实验数据：
NovoStart® SYBR High-Sensitivity qPCR SuperMix实验数据：
