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ChIP实验中最令你苦恼的是什么？

需要细胞量大？

步骤复杂？

耗时长？

重复性很差？

。。。

CUT&Tag技术的诞生无疑给了ChIP实验人一剂强心针。作为一种新的DNA-蛋白质互作技术，与传统的ChIP-Seq技术有着根本不同，以其实验周期短（＜10小时）、步骤简单（无需超声破碎和免疫共沉淀）、细胞起始量低（10万以下，乃至单细胞）、重复性好、信噪比高等优势成为众多研究人员的首选。

图1.CUT&Tag技术工作原理图

CUT&Tag技术的核心是pAG-Tn5融合蛋白（ChiTag），其中Protein AG能够结合抗体。在进行CUT&Tag实验时，首先将细胞与磁珠混合，然后进行靶蛋白特异性抗体（一抗）孵育，使抗体进入细胞与靶蛋白结合。为了放大信号，接着进行二抗孵育。最后孵育pAG-Tn5转座体，使得转座体进入细胞并与抗体结合，这样就把转座体间接的固定在靶蛋白上，随后加入Mg2+，激活Tn5酶的切割活性，打断靶蛋白结合的DNA区域。由于Tn5酶连有测序接头，在打断的同时直接在片段化的DNA上加接头，接着提取DNA，进行PCR扩增构建文库（图1）。

CUT&Tag与ChIP-Seq对比：

图2.CUT&Tag与ChIP-Seq对比

2019年近岸蛋白质推出CUT&Tag试剂盒，仅仅一个试剂盒就可以完成从靶蛋白结合DNA片段的获取到测序文库的构建。时至今日，CUT&Tag试剂盒引用文献已达十余篇。两年的实践表明，CUT&Tag技术可以探索组蛋白修饰、转录因子结合蛋白等全基因组范围内DNA-蛋白质互作，对动物、植物、微生物等实验室常用模式生物和细胞系具有广谱的适用性。

下面，我们就来看看利用CUT&Tag技术在DNA-蛋白质互作研究中又有哪些新动向。

CUT&Tag技术对全基因范围内蛋白和不同模式生物具有广谱适用性

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（1）全基因组范围内靶蛋白适用

A.组蛋白类适用。组蛋白修饰是表观遗传学研究的热点，常常与肿瘤的发生相关联。CUT&Tag技术已经用于多种组蛋白修饰的探索，准确定位核小体结构。例如常见的H3K4me1，H3K4me2，H3K4me3，H3K27ac，H3K27me3，H3K9me3， H3K36me3，H4K20me2等。近岸蛋白质部分客户文章及国外相关研究文献表明，这些组蛋白修饰符合实验预期。

图3.CUT&Tag技术在不同组蛋白修饰上的应用（部分展示）

B.转录因子类适用。转录因子结合位点较少，但是对于CUT&Tag技术而言，这并不是难事，且起始细胞为10万个甚至更少时也可以获得有效数据。近岸蛋白质部分客户文章证实CUT&Tag技术对转录因子同样适用，特别是靶蛋白无特异性抗体时，可以用Flag、GFP等标签蛋白抗体进行实验。

图4.CUT&Tag技术在不同转录因子上的应用（部分展示）

C.全基因组范围内蛋白适用。与ChIP-Seq一样，除了组蛋白和转录因子外，CUT&Tag技术在全基因组范围内结合的蛋白也适用。近岸蛋白质部分客户文章和国内外相关研究文献表明CUT&Tag技术能够很好地揭示染色体结构变化信息，特别是一些特殊的结构如R-Loop等。

图5.CUT&Tag技术在全基因组范围内的应用（部分展示）

（2）实验室模式生物适用CUT&Tag技术对实验室常规的模式生物和细胞系都有很好的适用性。这些模式生物包括人、动物、植物、微生物样本。特别是对于含有细胞壁的样本，可以在正式实验前去除细胞壁，提取细胞核进行实验（原生质体容易破碎，建议提取细胞核进行CUT&Tag实验）。目前，CUT&Tag技术已经应用到：HepG2 cell、RAW246.7 cell、KYSE cell、Human primary cell、Human Tissure cell、hPSCs、K562 cell、mouse ES cell、HEK293T cell、mouse MEFs cell、mouse embryos cell、mouse brain cell、NIH3T3 cell、CD4+T cell、HeLa S3 cell、H1 hESCs cell、CD8+T cell、果蝇细胞、muscle stem cell、拟南芥、水稻、棉花、酵母等细胞中。

图6.CUT&Tag技术在不同样本上的应用

CUT&Tag技术分析手段

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CUT&Tag技术最开始开发出来是用于建库测序的，后来经过众多研究人员的不断探索发现，CUT&Tag技术可以用于qPCR实验来定量特征峰，与传统的ChIP-qPCR的实验效果一致，甚至更优。即CUT&Tag技术的分析手段与传统ChIP一样：NGS测序和qPCR。

（1）CUT&Tag技术进行qPCR检测

事实证明，CUT&Tag实验所获取的DNA片段可以进行qPCR以检测目的条带的富集情况。CUT&Tag-qPCR与ChIP-qPCR类似，定量的长度、方法、引物设计等几乎完全一致。一般的实验流程为：细胞与磁珠结合—一抗孵育—二抗孵育—转座体孵育—片段化—DNA提取—PCR构建文库—文库纯化—qPCR检测。

图7.CUT&Tag-qPCR定位特征条带

（2）CUT&Tag实验结果进行高通量测序（NGS）分析

CUT&Tag本身是结合高通量测序的一类技术，所获取的实验结果也是测序文库。CUT&Tag的文库与ChIP-Seq类似，都是200-1000bp大小的文库。测序所得的数据可以用常规的分析软件进行分析。一般的实验流程为：细胞与磁珠结合—一抗孵育—二抗孵育—转座体孵育—片段化—DNA提取—PCR构建文库—文库纯化—质检—测序。整个实验流程约10小时。

（Daniel Chauss et al.2021）

图8.CUT&Tag技术进行NGS分析

CUT&Tag技术单细胞应用

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实验证明，CUT&Tag可以用于单细胞测序，而这是百万级细胞起始量ChIP-Seq技术所不能实现的。多篇文章表明CUT&Tag技术在单细胞测序方面有很好的应用。CUT&Tag技术在进行单细胞实验时需要搭建相应的平台，如10x genomics等，当然也可根据实际情况，自行搭建单细胞测序平台。

CUT&Tag技术诞生以来，越来越多的研究表明，这是一个可以完全替代ChIP-Seq的技术。

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参考文献：

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The Polycomb group protein Ring1 regulates dorsoventral patterning of the mouse telencephalon. [J]. Nature Communications. 2020.

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